本发明属于体外诊断试剂盒领域，具体涉及一种肌红蛋白检测试剂盒及其使用方法，所述肌红蛋白检测试剂盒包括：校准品、试剂R1、酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液及化学发光底物，所述试剂R1含有咪唑成分，其可以快速消除全血中的血细胞，有效避免血细胞吞进磁珠的可能；所述清洗液含有十二烷基硫酸钠成分，增强了清洗的效果，避免了化学发光底物的非特异性结合。本发明的试剂盒可直接使用手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，无需预先对全血样本进行预处理，就可直接进行检测，大大提高了检测速度，简化了操作步骤，扩大了试剂盒的适用范围，便于大范围推广应用。