本发明提供了一种叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤含量的检测方法。该方法以Agi l entSB‑CN为色谱柱，在高效液相色谱（HPLC）分离后，采用荧光检测器对叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤进行定性和定量检测，并进行方法学验证。经实验验证，该方法能够实现对叶酸中微量的光敏杂质6‑甲酰蝶呤和蝶呤6‑羧酸的同步定量检测，该方法具有专属性强、快速、灵敏度高、准确度高等优点。本发明首次建立了叶酸中微量光敏杂质6‑甲酰蝶呤和蝶呤6‑羧酸的同步定量检测方法，便于对叶酸进行质量控制，从而提高了叶酸原料药的质量和用药安全性。