本发明公开了一种八色荧光光谱校准试剂及其制备方法，采用人工设计合成的8个模板DNA，每个模板DNA模板分别包含1对引物的结合位点，并根据每个片段的预设长度，可实现片段长度与荧光精确控制。每对引物中的上游引物的5’端分别采用8种不同荧光标记，在一个特定反应体系内进行复合扩增，可同时获得含有八种荧光产物的荧光光谱校准试剂，无需进行单色荧光片段的混合和调配即可直接应用于荧光光谱校准。该方法极大的简化了荧光标准物的制备工艺流程，避免了复杂繁琐的操作。本发明的制备方法可以稳定的获得该标准物质，具有效率高，操作简便的特点。