本发明涉及微生物技术领域，具体公开一种乳酸菌的灭活方法及应用。所述乳酸菌的灭活方法，包括以下步骤：a、将乳酸菌进行高密度发酵培养，使得到的发酵液中乳酸菌的活菌数达到3.0×109cfu/ml‑1.0×1010cfu/ml；b、将所述发酵液先降温至23℃以下，然后升温至68℃‑72℃保温1.5h‑2.5h，再降温至23℃以下，离心收集菌泥；c、将菌泥与冻干保护剂混合，进行冷冻干燥，得到灭活乳酸菌粉。本发明提供的乳酸菌的灭活方法可以有效降低乳酸菌灭活过程中代谢产物的损失，保证菌体的完整性，进而保证灭活乳酸菌产品中有机酸、维生素、生物肽和低聚糖等活性物质的完整性，保持灭活乳酸菌产品的功效。