本发明公开了一种同时测定氯氰碘柳胺钠伊维菌素注射液中两主药含量的方法，涉及分析化学领域。本发明包括以下步骤：将十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相填充到液相色谱仪的色谱柱内；制备以乙腈‑甲醇‑水[（29:57:14），用2％磷酸溶液调节pH值至3.1]为流动相；精密称取氯氰碘柳胺钠、伊维菌素对照品适量，加甲醇稀释制成对照溶液；精密量取待测的氯氰碘柳胺钠伊维菌素注射液，用甲醇稀释，配制成供试品溶液；分别取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图；按外标法以峰面积计算供试品溶液的浓度。本发明解决了复方制剂氯氰碘柳胺钠伊维菌素注射液中两主药含量测定的问题。