本发明公开了一种同时测定多种维生素注射液中3种脂溶性维生素含量的方法，涉及分析化学领域。本发明包括以下步骤：将十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相填充到液相色谱仪的色谱柱内；制备甲醇‑乙腈‑乙酸乙酯作为流动相；精密称取维生素A、维生素D3与维生素E对照品适量，加异丙醇稀释制成对照溶液；精密量取待测的多种维生素注射液，用异丙醇稀释，配制成供试品溶液；分别取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪进行等度洗脱，记录色谱图；按按外标法以峰面积计算供试品溶液的浓度。本发明解决了现有技术采用三个不同检测波长，梯度洗脱、流动相复杂，样品处理过程繁琐费时的问题。