一种分离测定卡培他滨及其杂质的方法，包括以下步骤，1）取卡培他滨或含有卡培他滨的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.5mg/ml的试样溶液；2）取步骤1）得到的试样溶液，加稀释剂稀释，得到浓度为5μg/ml的对照溶液；3）分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1）试样溶液、步骤2）对照溶液，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，记录色谱图，按照自身对照法计算杂质含量。本发明分离测定方法的操作简单、方便，可有效分离测定卡培他滨及其杂质，有效控制卡培他滨及其产品的质量。