一种分离测定帕博西尼及其杂质的方法，具有以下步骤，1）取帕博西尼或含有帕博西尼的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1‑10mg/ml的试样溶液；2）取步骤1）得到的试样溶液，加稀释剂稀释50‑1000倍，得到对照溶液；3）采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8‑1.2ml/min，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为浓度是0.0001‑1.0mol/L的缓冲溶液，缓冲溶液中用磷酸调pH值至1‑5，流动相B为甲醇，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱；4）分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1）试样溶液、步骤2）对照溶液，进样量为5μl‑100μl，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中杂质的分离测定。