一种分离测定瑞博西尼及杂质的方法，包括以下步骤，1）取瑞博西尼加稀释剂溶解，得到浓度为0.1‑10mg/ml的试样溶液；2）取步骤1）的试样溶液加稀释剂稀释50‑1000倍，得到对照溶液；3）采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8‑1.2ml/min，流动相由浓度是0.0001‑1.0mol/L的缓冲溶液和乙腈组成，采用梯度洗脱方式进入色谱柱；4）分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1）试样溶液、步骤2）对照溶液，进样量为5μl‑100μl，利用210nm至290nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中杂质的分离测定。本发明操作简单、方便，可有效实现瑞博西尼及杂质、杂质与杂质之间的分离和测定，从而实现控制瑞博西尼及其产品的质量的目的。