本发明提供了一种乙酰半胱氨酸及其有关物质的检测方法，涉及药物分析技术领域。有关物质包括乙酰半胱氨酸生产和储存过程中引入的杂质和/或降解产物。该检测方法通过高效液相色谱将乙酰半胱氨酸及其有关物质进行分离和检测，其中，高效液相色谱采用以阴阳离子嵌入修饰烷基键合硅胶为固定相的色谱柱，并采用磷酸水溶液为流动相A和磷酸乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，以将乙酰半胱氨酸及其有关物质完全分离。本发明的检测方法可将乙酰半胱氨酸及其有关物质完全分离，从而提高检测的灵敏度和准确度。