本发明公开了一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定性、定量测定方法。采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的百日咳毒素产品和百白破疫苗活性蛋白百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的定量方法。本方法首次从复杂的疫苗基质中筛查出可用于各活性疫苗蛋白定性和定量分析的特征肽段，这些肽段与其它所报道的蛋白肽段不同，不能通过蛋白检索库获得，也不能通过这些疫苗蛋白的氨基酸序列简单得出。可实现不同生产厂家、不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的同时定量。