本发明公开了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法：（1）标准品的酶解；（2）固相萃取富集目标肽段；（3）高效液相色谱串联质谱分析；（4）绘制标准曲线，得标准工作曲线方程；（5）样品检测，计算得到样品中各特征肽段的浓度；（6）计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率。本发明实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测，其中破伤风蛋白涉及20个监测位点，CRM197涉及16个监测位点。本发明不仅可以检测残留蛋白含量，还可以评价多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合位点的结合率，也可用于多糖或蛋白残余率相同但活性和毒性不同的多糖蛋白结合疫苗的研究，可为改进多糖蛋白结合工艺提供直接的监测方法。