本发明公开了测定COVID‑19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段，包括测定结构蛋白S、S蛋白RBD区域、结构蛋白E、结构蛋白M和结构蛋白N的5种肽段。本发明还公开了COVID‑19疫苗中结构蛋白含量的测定方法：对待测样品进行酶解，对酶解液进行高效液相色谱串联质谱分析，得色谱图，计算5种特异性肽段的响应峰面积，代入标准工作曲线，计算得出待测样品中结构蛋白S、S蛋白RBD区域、结构蛋白E、结构蛋白M和结构蛋白N的含量。本发明通过酶解条件优化、质谱条件优化、稳定性、灵敏度、线性、重复性等，筛选出5种抗原蛋白适合的定量肽段。本发明可用于不同厂家、不同批次灭活COVID‑19疫苗、载体COVID‑19疫苗中5种抗原蛋白的含量测定，对改进疫苗研发、生产和质量评价具有借鉴意义。